Linie komórkowe HEK-293 i PER.C6

Skróty: COVID-19 (coronavirus disease) – choroba spowodowana przez SARS-CoV-2, SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) – koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2

Wprowadzenie

Linie komórkowe pochodzące z materiału ludzkiego wykorzystuje się do produkcji szczepionek od lat 60. XX wieku. W Polsce aktualnie dostępne są szczepionki, w których procesie wytwarzania stosuje się dwie linie komórkowe pochodzące z ludzkich komórek zarodkowych – linię WI-38 oraz MRC-5. Linia WI-38 służy do namnażania wirusa różyczki (szczep RA 27/3) wchodzącego w skład skojarzonych szczepionek przeciwko odrze, śwince i różyczce (preparaty MMRVax-Pro, Priorix) lub przeciwko odrze, śwince, różyczce i ospie wietrznej (preparat Priorix Tetra). Jest to linia diploidalnych komórek zarodka ludzkiego uzyskana z materiału pobranego w wyniku zabiegu sztucznego poronienia, który decyzją amerykańskiego sądu przeprowadzono w 1964 roku. Linia komórkowa MRC-5 służy natomiast do namnażania wirusa zapalenia wątroby typu A (HAV), który wchodzi w skład szczepionek przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu A (preparaty Havrix, Twinrix) oraz do namnażania wirusa ospy wietrznej (preparat Varilrix). Linia MRC-5 to linia diploidalnych komórek zarodka ludzkiego, którą również uzyskano z materiału pobranego w wyniku zabiegu sztucznego poronienia przeprowadzonego w 1966 roku. W obu wspomnianych przypadkach zabiegi aborcji przeprowadzono z przyczyn pozamedycznych i ich celem nie było pobranie materiału do wyprowadzenia linii komórkowych. Obie linie komórkowe są sztucznie podtrzymywane i pasażowane (wielokrotnie replikowane, odtwarzane przez podział komórek w laboratoriach) jako linie ciągłe i do dzisiaj wykorzystuje się je w procesie wytarzania współczesnych szczepionek. Ale nie tylko. Linie komórkowe, takie jak WI-38 czy MRC-5, stosuje się również w procesie wytwarzania dostępnych na rynku leków przeciwko różnym chorobom, w tym hemofilii, reumatoidalnemu zapaleniu stawów i mukowiscydozie. Linie ludzkich komórek zarodkowych wykorzystuje się także w intensywnych pracach nad bezpieczną i skuteczną szczepionką przeciwko chorobie spowodowanej przez koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (COVID-19), będącej przyczyną trwającej pandemii.

Szczepionki przeciwko COVID-19

Wśród kilkudziesięciu szczepionek przeciwko COVID-19 ocenianych na różnych etapach badań klinicznych, w procesie wytwarzania co najmniej 5 z nich wykorzystuje się jedną z dwóch linii komórkowych pochodzących z ludzkich komórek zarodkowych (p. tab.).

Jest to linia komórek HEK-293 oraz PER.C6, które znalazły zastosowanie w produkcji szczepionek wektorowych. Linie ludzkich komórek zarodkowych wykorzystywane są jako swego rodzaju miniaturowe „fabryki” do produkcji ogromnej ilości wektorów wirusowych niezdolnych do replikacji, tj. zmienionych w taki sposób, aby nie mogły się namnażać. Wirus–wektor pełni w szczepionce funkcję nośnika dla genu kodującego wybrane immunogenne białko wirusa SARS-CoV-2. Kiedy podajemy pacjentowi szczepionkę zbudowaną z adenowirusa z wbudowanym genem kodującym białko S koronawirusa, osoba zaszczepiona zaczyna wytwarzać to białko, co uruchamia immunologiczne mechanizmy ochrony przed COVID-19 i/lub koronawirusem zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2).

Linia komórkowa HEK-293

Linię komórkową HEK-293 wykorzystuje się do produkcji dwóch rodzajów eksperymentalnych szczepionek przeciwko COVID-19 – szczepionki opartej na wektorze adenowirusowym oraz białkowej szczepionki podjednostkowej (p. tab.). Do tej pory linii tej nie wykorzystywano w procesie wytwarzania żadnej z dostępnych na rynku szczepionek stosowanych u ludzi. Jedną ze szczepionek przeciwko SARS-CoV-2, do produkcji której wykorzystuje się linię HEK-293, jest preparat o nazwie roboczej „ChAdOx1 nCoV-19”, opracowany przez naukowców z Uniwersytetu w Oksfordzie w Wielkiej Brytanii oraz firmę AstraZeneca. Szczepionka ta jest oparta na wektorze adenowirusowym (szympansim) niezdolnym do replikacji, pełniącym rolę nośnika dla genu kodującego białko szczytowe S SARS-CoV-2. Linię komórkową HEK-293 wykorzystuje się w procesie wytwarzania tej szczepionki do przygotowania adenowirusa szympansiego (wektora). Linia komórek HEK-293 jest swoistą linią komórek uzyskanych z ludzkich embrionalnych komórek nerki. Komórki HEK-293 pozyskano przez transfekcję hodowli ludzkich embrionalnych komórek nerki w laboratorium Alex van der Eb na Uniwersytecie w Leiden, w Holandii. Komórki uzyskano z materiału pobranego w wyniku zabiegu sztucznego poronienia przeprowadzonego zgodnie z prawem w 1972 roku. Nazwa linii komórkowej HEK odnosi się do pochodzenia linii (Human Embryo Kidney), natomiast liczba 293 dotyczy numeru samego badania. W wyniku kilku transfekcji (w tym wypadku dotyczyło to wprowadzenia do komórki adenowirusa) uzyskano klon komórek, które po przystosowaniu do hodowli tkankowej rozwinęły się w stosunkowo stabilną, zdolną do nieograniczonego wzrostu linię komórek. Linię HEK-293 stosuje się w biologii komórek od wielu lat. Znalazła ona szerokie zastosowanie w biotechnologii przemysłowej, do wytwarzania białek terapeutycznych oraz wirusów w terapii genowej.

Linia komórkowa PER.C6

Linię komórkową PER.C6 wykorzystuje się w procesie wytwarzania szczepionki wektorowej z niezdolnym do replikacji adenowirusem szympansim opracowywanej przez firmę Janssen Research & Development. Linię komórkową PER.C6 wyprowadzono z tkanki siatkówki zarodka ludzkiego uzyskanej w wyniku zabiegu sztucznego poronienia przeprowadzonego w 1985 roku. Opracowano ją, podobnie jak linię HEK-293, w laboratorium Alex van der Eb na Uniwersytecie w Leiden, w Holandii. Linię komórkową PER.C6 wcześniej wykorzystywano w procesie wytwarzania dopuszczonej do obrotu szczepionki przeciwko wirusowi ebola (preparat Zabdeno [„Ad26.ZEBOV”] podawany łącznie z preparatem Mvabea [„MVA-BN-Filo”]).

Dlaczego linie pozyskane z ludzkich komórek zarodkowych stosuje się do wytwarzania szczepionek?

Wirusy potrzebują do wzrostu żywych komórek. Do prowadzenia badań nad chorobami człowieka potrzebujemy komórek ludzkich, które posiadają określone właściwości. Niektóre wirusy namnażają się efektywnie tylko w ludzkich komórkach. Badacze, opracowując metody namnażania wirusów w laboratorium, odkryli, że najlepsze do wykorzystania są komórki uzyskane wyjściowo z komórek zarodkowych. Linie komórek wyprowadzone z komórek zarodkowych zachowują zdolność do podziału. Ze względu na możliwość utrzymywania komórek w bardzo niskich temperaturach w warunkach ciekłego azotu, naukowcy mogą nadal używać tych samych linii komórkowych, które wyizolowano w przeszłości. Komórki muszą być sterylne i wolne od potencjalnych czynników szkodliwych. Aktualnie używane linie komórkowe nie są pierwotnie pobranymi komórkami tylko ich potomkami.

W procesie wytwarzania szczepionek możemy korzystać z linii komórkowych wyprowadzonych wiele lat temu również dlatego, że nie podlegają one transformacji nowotworowej. Dodatkowym aspektem przemawiającym za stosowaniem komórek przypominających komórki człowieka jest cały proces kontroli szczepionek na poszczególnych etapach wytwarzania, w tym szczegółowej kontroli linii komórkowych oraz przy zwalnianiu kolejnych serii preparatu do obrotu (p. także Kontrola jakości i bezpieczeństwa szczepionek – przyp. red.). Szczepionki, jako produkty lecznicze, immunologicznie należą do najlepiej przebadanych produktów medycznych. W całym procesie produkcji szczepionek ważna jest pewność, że kolejne partie szczepionki są takie same, jak wcześniejsze, dlatego korzystanie z dobrze przebadanych i przetestowanych linii komórkowych stanowi jeden z ważnych elementów bezpieczeństwa szczepionki (przebadane i certyfikowane jako bezpieczne).

Należy podkreślić, że chociaż wirusy szczepionkowe hoduje się na liniach komórek zarodkowych, to już sama szczepionka (gotowy do użycia preparat) nie zawiera tych komórek ani fragmentów ludzkiego DNA. Wynika to z tego, że wirusy, namnażając się w linii komórkowej, prowadzą do całkowitego zniszczenia danej komórki. Dodatkowo po namnożeniu wirusa jest on poddawany oczyszczaniu w celu usunięcia pozostałości komórkowych i substancji dodawanych do podłoża, w którym utrzymywany jest wzrost linii komórek. W trakcie oczyszczania następuje również rozpad pozostałego DNA komórkowego.

Czy linie ludzkich komórek zarodkowych można zastąpić innymi?

Konieczność produkcji szczepionek z wykorzystaniem linii komórek wyprowadzonej z materiału ludzkiego do hodowli (namnażania) wirusa szczepionkowego lub wektora wirusowego wynika z kilku przesłanek, głównie dotyczących bezpieczeństwa. Linia ta nie jest zmodyfikowana genetycznie i nie została unieśmiertelniona, czyli przekształcona w linię nowotworową. Użycie linii unieśmiertelnionych mogłoby wprowadzić do szczepionki geny nowotworowe. Ze względów bezpieczeństwa linii ludzkich komórek zarodkowych nie można także zastąpić linią pochodzenia zwierzęcego, ponieważ byłoby to związane z ryzykiem wprowadzenia innych wirusów (przykładem jest wykrycie w latach 60. XX w. wirusa SW40 w „żywej” szczepionce przeciwko polio, przy produkcji której wirus szczepionkowy namnażano w linii komórek pochodzenia małpiego). Wirusy szczepionkowe oraz wektory wirusowe są zaadoptowane do linii komórek pochodzenia ludzkiego i w trakcie produkcji zmiana w ich właściwościach jest mało prawdopodobna. W przypadku użycia innych linii wirus szczepionkowy dostosowałby się do nowej linii komórek, co wiąże się z ryzykiem zmiany jego właściwości. W przypadku użycia linii komórek zwierzęcych należałoby też uwzględnić ryzyko wystąpienia reakcji alergicznych na obce białko.

Podsumowanie

Wykorzystywane aktualnie linie ludzkich komórek zarodkowych są specjalnie przebadane i posiadają odpowiednie certyfikaty bezpieczeństwa. Są bardzo dobrze scharakteryzowane i od dziesięcioleci skutecznie stosowane w produkcji dopuszczonych do obrotu leków dla ludzi. Żadna z dostępnych na rynku szczepionek wirusowych, a także żadna z opracowywanych szczepionek przeciwko COVID-19 nie zawiera materiału pochodzącego od człowieka. Wirusy wykorzystywane w szczepionkach są hodowane w warunkach laboratoryjnych w specjalnych liniach komórek, które wyjściowo w latach 60.–70. XX wieku wyprowadzono z materiału pochodzącego z ludzkich komórek zarodkowych pobranego w wyniku zabiegu sztucznego poronienia. Aborcje przeprowadzono z przyczyn pozamedycznych, po wyroku sądu. Żadnej z tych aborcji nie wykonano w celu pobrania komórek zarodka do otrzymania linii komórkowych. Te same linie komórek uzyskane z komórek zarodka w przeszłości są przechowywane i namnażane do dziś, a dzięki nim powstały nie tylko wspomniane szczepionki, ale również wiele innych, zaawansowanych leków.